1. Государственные стандарты База ГОСТ от ФГУП "Стандартинформ" update 10.10.2019, items 44047
  2. Нормативно-техническая документация База нормативно-технических документов update 01.01.2019, items 128867
  3. Строительная документация Архив нормативных актов и документов update 2011, items 23952
Федеральное агентство по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт) ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» Российский союз промышленников и предпринимателей (РСПП) Федеральная служба по аккредитации (Росаккредитация) Межгосударственный совет по стандартизации, метрологии и сертификации (МГС) Евразийская экономическая комиссия (ЕЭК) Министерство промышленности и торговли Российской Федерации (МИНПРОМТОРГ) Евразийский экономический союз (ЕАЭС)

МУК 4.2.3528-18 Метод микробиологического измерения концентрации Corynebacterium glutamicum Н150 (Brevibacterium flavum) ВКПМ В-12692 в воздухе рабочей зоны / 4 2 3528 18

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения
концентрации Corynebacterium glutamicum
Н150 (Brevibacterium flavum)
ВКПМ В-12692 в воздухе рабочей зоны

Методические указания
МУК 4.2.3528-18

Москва 2018

1. Разработаны и подготовлены ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (проф., д.б.н. Н.И. Шеина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. № 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 1 февраля 2018 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

1. Назначение и область применения. 2

2. Биологическая характеристика штамма Corynebacterium glutamicum Н150 (Brevibacterium flavum) ВКПМ В-12692 и его гигиенический норматив в воздухе рабочей зоны.. 2

3. Пределы измерений. 3

4. Метод измерений. 3

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы.. 3

5.1. Средства измерений. 3

5.2. Вспомогательные устройства и материалы.. 3

5.3. Реактивы и питательные среды.. 4

6. Требования безопасности. 4

7. Требования к квалификации операторов. 4

8. Условия измерений. 4

9. Приготовление 2LВ-среды.. 4

10. Проведение измерения. 5

10.1. Отбор проб воздуха. 5

10.2. Выполнение анализа. 5

11. Вычисление результатов измерения. 5

12. Оформление результатов измерений. 6

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации

_______________________ А.Ю. Попова

1 февраля 2018 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации
Corynebacterium glutamicum Н150 (Brevibacterium flavum)
ВКПМ В-12692 в воздухе рабочей зоны

Методические указания
МУК 4.2.3528-18

1. Назначение и область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Corynebacterium glutamicum H150 (Brevibacterium flavum) ВКПМ В-12692 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500000 клеток в 1 м3 воздуха.

1.2. Методические указания носят рекомендательный характер.

2. Биологическая характеристика штамма Corynebacterium
glutamicum
Н150 (Brevibacterium flavum) ВКПМ В-12692 и
его гигиенический норматив в воздухе рабочей зоны

Штамм Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) H150 происходит от одноименного штамма ВКПМ В-12504, продуцент лизина, не является генетически-инженерно-модифицированным штаммом.

Corynebacterium относится к роду бактерий и порядку Actinomycetales. Виды этого рода являются грамм положительными аэробными микроорганизмами и представлены неподвижными овальными или слегка удлиненными палочками, которые не образуют спор.

Штамм растет на средах, обогащенных углеводами: МПА, L-среда, 2LВ-среда с мальтозой (20,0 г/л). Колонии интенсивно желтого цвета округлой формы, приподняты над поверхностью, края колоний ровные, консистенция нетягучая, клетки легко отделяются друг от друга. Оптимальная температура - 30 °С, время выращивания - 1 - 2 сут.

Депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика под номером ВКПМ В-12692.

Штамм Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) H150 ВКПМ В-12692 не является фито- и зоопатогенным, а также не входит в состав 4 групп патогенности в соответствии с Санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами» в редакции Дополнений и изменений 2, утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 29.06.2011 № 86.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 50000 кл/м3.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха рабочей зоны клеток и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы.

5.1. Средства измерений

Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 - 790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности ±2,5 мм рт. ст.

ТУ 2504-1799-75

Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности ±0,2 мг

ГОСТ Р 53228-08

Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2

ГОСТ 1770-74

Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3

ГОСТ 29227-91

Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3

ГОСТ 1770

Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0 - 55 °С

ТУ 25-2021.003-88

Аспирационный аппарат и устройство для отбора проб воздуха

Примечание. Допускается использование других средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

5.2. Вспомогательные устройства и материалы

Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 ±5) °С

ТУ 9452-010-00141798-02

Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (30 ± 2) и (37 ± 2) °С

ТУ 9452-002-00141798-97

Автоклав электрический

ГОСТ 9586-75

Стерилизаторы паровые медицинские

ГОСТ Р ЕН 13060-11, ГОСТ Р 51935-02

Дистиллятор

ТУ 4952-007-33142130-2000

Облучатель бактерицидный настенный

ТУ 9444-015-03965956-08

Холодильник бытовой

ГОСТ 26678-85

Микроскоп биологический с иммерсионной системой

Лупа с увеличением ×10

ГОСТ 25706-83

Пробирки типов П1, П2

ГОСТ 25336-82

Спиртовки лабораторные стеклянные

ГОСТ 23932-90

Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов

ГОСТ 23932-90

Воронки конусные диаметром 40 - 45 мм

ГОСТ 25336-82

Груша резиновая

ТУ 9398-005-0576-9082-03

Петля бактериологическая

Марля медицинская

ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая

ГОСТ 25556-81

Бумага фильтровальная лабораторная

ГОСТ 12026-76

Примечание. Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.3. Реактивы и питательные среды

Агар микробиологический

ГОСТ 17206-96

Вода дистиллированная

ГОСТ 6709-90

Дрожжевой экстракт, сухой

ГОСТ 17206-84

Натрий хлористый

ГОСТ 4233-77

Патока мальтозная

ГОСТ 55316-12

Спирт этиловый технический

ГОСТ 17299-78

Спирт этиловый ректификованный

ГОСТ Р 51652-2000 или ГОСТ 18300-87

Триптон

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток бактерий в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. Санитарные правила «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СП 1.3.2322-08.

6.2. Дополнения и изменения 1 к СП 1.3.2322-08. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2518-09.

6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76.

6.4. Требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

- температура воздуха (20 ± 5) °С;

- атмосферное давление (760 ± 20) мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80 %.

9. Приготовление 2LВ-среды

Для приготовления среды 2LB используют отдельные компоненты среды следующего состава (г/1000 см3): триптон - 20,0 г; 50 %-я патока мальтозная - 20,0 г; дрожжевой экстракт - 10,0 г; агар-агар - 15,0 г; натрий хлористый - 10,0 г; дистиллированная вода - 1000 см3.

Сухие компоненты растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.

Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 - 500 см3 и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °С в течение 10 дней, не более. Раствор мальтозы 50 %-й готовится и стерилизуется отдельно. При разливе среды в чашки Петри добавляется из расчета 40 мл/л 50 %-я мальтоза.

10. Проведение измерения

10.1. Отбор проб воздуха

Отбор проб воздуха проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением 1 «ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны» и ГОСТ 8.563-96 «ГСП. Методики выполнения измерений».

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

10.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методом стерильную агаризованную среду (2LB) расплавляют, остужают до 50 - 60 °С и разливают в чашки Петри. Затем добавляют из расчета 40 мл/л стерилизованный 50 %-й раствор мальтозы.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °С не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре 2 - 8 °С не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (30 ± 2) °С. Через 1 - 3 суток проводят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) H150 ВКПМ В-12692 высевается на 2 - 3 чашки используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.

11. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток проводят по формуле:

К = (П×1000)/С×Т кл/м3, где

К - концентрация штамма в воздухе, кл/м3;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин;

Т - время аспирации, мин.

12. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по ниже приведенной форме.

Протокол №
количественного микробиологического анализа
Corynebacterium glutamicum H150 ВКПМ В-12692 в воздухе рабочей зоны

1. Дата проведения анализа ___________________________________________________

2. Рабочее место (профессия работающего) ______________________________________

3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) __________________________________________________

3. Вид пробоотборника _______________________________________________________

4. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб __________

5. Питательная среда, время инкубации _________________________________________

6. Результаты испытания ростовых свойств питательной среды _____________________

7. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний) __________________________________________________________

8. Результаты идентификации микроорганизмов Corynebacterium glutamicum Н150 ВКПМ В-12692 (морфологические признаки) ____________________________________

9. Результаты расчёта концентрации штамма ____________________________________

10. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДКр.з. _______________________

11. Отбор пробы проведён (Ф. И. О., должность, дата, подпись) ____________________

12. Идентификация штамма и расчёт концентрации проведены (Ф. И. О., должность, дата, подпись) ______________________________________________________________